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DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)真核蛋白操作步骤
日期：2023-07-12浏览：325次
Ⅰ 实体组织蛋白的提取
1． 在每1mL 冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制剂， 1 μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用。
2． 每100mg固体组织置于培养皿中，剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5～1 mL冷 Lysis Buffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；
3． 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，离心10000转/分，4℃离心5 min；
4． 取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford法、BCA法）；
5． 分装保存于-70℃,避免反复冻融。
Ⅱ 培养细胞蛋白提取
1． 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；
2． 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中， 1000转/分离心10 min，再用10mL/150mm培养板的冷PBS，1000转/分离心5 min洗两次；
3． 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入10μL磷酸酶抑制剂， 1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用。
4． 细胞洗涤后，转至新的预冷的离心管中，加入上述配制好的冷Lysis Buffer，加入量如下表所示：
细胞数量
Lysis Buffer加入量
107个
0.5 mL～1 mL
5×106个
0.2 mL～0.5 mL
5．置于4℃摇床平台上，温和振荡15 min；
6． 14,000rpm，4℃离心15min，取上清为全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford法、BCA法）；
7． 分装保存于-70℃,避免反复冻融
DNA碱性胶上样液（1.5 mL）
DNA碱性胶上样液（10 mL)
DNA尿素-PAGE上样液（1.5 mL）
DNA尿素-PAGE上样液（10 mL）
DNA上样液（红），6×（非甘油）（见关联产品）
DNA上样液（蓝），6×（非甘油）（见关联产品）
DNA上样液，6×（红）
DNA上样液，6×（蓝）
miRNA尿素-PAGE上样液（1.5 mL）
miRNA尿素-PAGE上样液（10 mL）
三合一RNA上样液（A型）
三合一RNA上样液（B型）
核酸染料
SYBR Green Ⅱ核酸染料
超快核酸银染试剂盒
电泳级SYBR Green I
电泳级耐热型SYBR染料
绿如蓝核酸染料（UV）（0.5 mL）
绿如蓝核酸染料（UV）（1.5 mL）
绿如蓝核酸染料（可见光型）
溴化乙锭干粉
溴化乙锭清除剂（EB清除剂）
溴化乙锭溶液（1.5 mL）
