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BY4741 感受态细胞操作方法

日期:2021-07-12浏览:53次

BY4741 感受态细胞操作方法(以下操作均按无菌条件的标准进行)

1 取感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中,置于冰浴中。
●  一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl,可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。
以下实验以100 μl感受态细胞为例。
2 向感受态细胞悬液中加入目的DNA(100 μl 的感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和),轻轻旋转离心管以混匀内容物,在冰浴中静置30 分钟。
3 将离心管置于42℃水浴中放置60-90 秒,然后快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却2-3 分钟,该过程不要摇动离心管。
4 向每个离心管中加入900 μl 无菌的SOC 或LB 培养基(不含抗生素), 混匀后置于37℃摇床振荡培养1 小时(160-220 转/分钟),目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。
5 将离心管内容物混匀,吸取100 μl 已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOB 或LB 固体琼脂培养基上,用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收,倒置平板,37℃培养12-16 小时。
●  涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA 总量较多,可取更少量转化产物涂布平板;反之,如转化的DNA 总量较少,可取200-300 μl 转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少,可通过离心(4,000 rpm, 2分钟)后吸除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。(涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板)

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